Současná elektronová mikroskopie v biologii

Transmisní i skenovací elektronový mikroskop (dále TEM a SEM) byly od svého počátku využívány pro výzkum biologických objektů, přestože biologické vzorky nejsou pro pozorování v elektronových mikroskopech nejvhodnější. Mají vysoký obsah vody, který je neslučitelný s vakuem vnitřních prostorů mikroskopů, a v jejich hmotě převažují lehké atomy, což vede k nedostatečné interakci a rozptylu energetických primárních elektronů. Proto se musí biologické preparáty zbavovat vody a do jejich struktury se musí přidávat atomy těžkých kovů. Tato příprava vzorků je často příčinou výrazných změn. Současný rozvoj biologické elektronové mikroskopie se zaměřuje na hledání možností jak pozorovat biologické preparáty co nejblíže jejich nativnímu stavu.

Transmisní elektronová mikroskopie

Řada novinek se objevilo v transmisní elektronové mikroskopii. Zmíníme se jen o dvou z nich.

• Elekronoví mikroskopici odjakživa snili o prostorovém zobrazení pozorovaných objektů, ať už šlo o buňky, molekuly či technické materiály. Skenovací elektronová mikroskopie umožňuje náhled pouze na povrch struktur, klasická prozařovací elektronová mikroskopie umí pracovat jen s tenkými řezy, jejichž příprava je obtížná a skládání výsledného obrazu nepřesné. Nedávno se však objevily komerčně dostupné přístroje, jež zvládají prostorový pohled dovnitř zkoumaných útvarů. Využívají tomografii – metodu založenou na sběru obrazu při otáčení preparátem a následné počítačové rekonstrukci. Během necelé desítky let vyzrála elektronová tomografie do uživatelsky přátelské metody, kterou může používat každý zkušenější mikroskopik. Dá se očekávat, že v nejbližších letech bude naprosto nezbytným nástrojem výzkumu v biologii, medicíně, materiálových i technických vědách.

  Jak elektronová tomografie pracuje? Systém sestává z prozařovacího elektronového mikroskopu s dostatečným urychlovacím napětím, ¹⁾ aby mohly být použity tlustší preparáty než v klasické mikroskopii, a z výkonného počítače. V mikroskopu je vestavěn nesmírně přesný držák preparátu, který se dokáže otáčet bez významných otřesů a posuvů po malých krocích od –70° do +70°. Celý proces (otáčení držáku, kontrola parametrů zobrazení při každém kroku, snímání jednotlivých obrázků) je plně automatizován. Typická sada postupně pořízených tomografických snímků obsahuje asi 140 záběrů získaných digitální kamerou za 20 minut (obrázek A). Počítačové zpracování začíná přesným „napasováním“ jednotlivých obrázků nad sebe pomocí složitých matematických (plně automatizovaných) postupů (obrázek B). Poté práci přebírá software, jenž vytvoří přesnou prostorovou rekonstrukci struktur, které nás zajímají ( C). Tímto způsobem lze rekonstruovat například buněčné organely. Program nám standardně umožňuje rekonstrukcí otáčet, provádět řezy nebo vytvořit animovaný film, aby ještě názorněji vynikly tvary a interakce s dalšími útvary.

• Dalším velkým příslibem pro budoucnost studia materiálů tvořených lehkými prvky, kam patří i biologické objekty, se zdá být nízkonapěťový elektronový mikroskop, jehož autorem je Armin Delong. Jde o nový unikátní přístroj, který vznikl kombinací optického a elektronového mikroskopu. Tento malý stolní mikroskop poskytuje zvětšení až dvěstěticískrát při rozlišovací schopnosti v TEM modu 1,5 nm ²⁾ .

  K velmi příjemným vlastnostem mikroskopu (kromě výrazně nižší pořizovací ceny) patří i schopnost pracovat při nízkém urychlovacím napětí 5 kV. Důsledkem této skutečnosti je vysoký kontrast výsledného obrazu (obrázek), umožňující vynechat v přípravě preparátů kontrastující procedury. Nevýhodou je, že takto urychlené primární elektrony mají nízkou penetrační schopnost. Proto se musí připravovat vzorky v podobě ultratenkých řezů s tloušťkou okolo 20 nm. K řešení tohoto problému může přispět oscilující diamantový nůž, který se již chystá pro trh.

  Nejméně polovinu úspěchu představují v elektronové mikroskopii biologických objektů dobře připravené preparáty. V posledních letech nastupují kryometody, které fi xují vzorek ve zlomku vteřiny a bez význačných změn vůči nativnímu stavu. Stále častěji se využívají pro imunolokalizace buněčných složek (metoda Tokuyasu), protože lépe zachovávají schopnost tkáně vázat antigeny a zároveň zlepšují přístup protilátek k vazebným místům. Své místo si při přípravě preparátů klasickou chemickou cestou našel mikrovlnný ohřev, který zvyšuje kvalitu a zároveň zkracuje časy potřebné pro jednotlivé kroky.

Skenovací elektronová mikroskopie

Na názorném příkladu se podívejme, co snahy o přiblížení se nativnímu stavu při pozorování biologických vzorků přinesly ve skenovací elektronové mikroskopii. Svěrací průduchové buňky z povrchu blahovičníkového listu na sebe upozornily „nepatřičným“ chováním při prohlížení ve vysokovakuovém SEM. Průduchy na pokoveném povrchu listu výrazně „svítily“ (obrázek A) a vyvolaly tak náš zájem zjistit, co je příčinou zvýšené emise sekundárních elektronů – jestli jde o hranový jev, nebo o vlastnosti epikutikulárních vosků, které v silné vrstvě chrání list před vysycháním.

Povrch blahovičníkového listu jsme si prohlédli pomocí environmentálního skenovacího elektronového mikroskopu. Tento mikroskop má vnitřní prostor tubusu rozdělený (ve směru od elektronového děla k preparátové komoře) do kaskády komor, v nichž stoupá tlak. Poměry v preparátové komoře proto dovolují prohlížet vzorek obsahující vodu. Cestu sekundárních elektronů k detektoru navíc zprostředkovává ionizace zbytkových molekul plynu, která také eliminuje náboje na povrchu preparátu, a vzorek není třeba pokrývat vodivou kovovou vrstvou. Ani tento mikroskop nám ale neumožnil odhalit tajemství průduchových svěracích buněk (obrázek B). Stále se okolo nich projevoval silný svítící efekt, ba co víc, jeho intenzitu ovlivňovalo nastavení technických parametrů (tlak v preparátové komoře, rychlost přeběhu paprsku či předpětí sběrné elektrody na ionizačním detektoru).

Důkladně prozkoumat dutinu před průduchy a určit příčinu nabíjení svěracích buněk se nám podařilo až pomocí SEM s autoemisní tryskou. Tento typ mikroskopu dosahuje vysokého rozlišení i při nízkém urychlovacím napětí, protože je zmenšen průměr primárního svazku elektronů – za ideálních podmínek může být menší než 1 nm. Navíc byl mikroskop vybaven speciálním kryo-nástavcem, který umožnil pokovit a pozorovat zmražený preparát. Získané snímky (obrázek) objasnily, že předprůduchovou dutinu jemně vystýlají krystaly epikutikulárních vosků, na jejichž hranách vznikalo příliš mnoho detekovaného signálu.

Jak je vidět i z tohoto stručného přehledu, elektronová mikroskopie ještě zdaleka nevyčerpala všechny své možnosti a stále přináší nové poznatky o biologickém mikrosvětě a jeho zákonitostech.