Komerční prezentace
Registrace uživatele

Přihlašte se k odběru informací, novinek, získejte přístup do diskuzního fóra.

Vesmír č. 9
Vesmír č. 9
Toto číslo vychází
1. 9. 2017
Novinky
Zdarma jedno celé číslo Vesmíru v pdf.
• Zářijové číslo Vesmíru
reklama

Kuličky nejsou jen na hraní

aneb Lékařské a biologické technologie využívají magnetické polymerní nano- a mikročástice

Publikováno: Vesmír 93, 106, 2014/2
Obor: Biochemie

Kutálející se objekty, ať již kuličky, koule či míče, jsou odnepaměti nedílnou součástí mnoha her, které jsou přitažlivé nejen pro malé děti, koťata a štěňata. Různé hry s míčem jsou zachyceny již na malbách ze starého Egypta. Kuličky však našly ve společnosti i řadu praktických využití, např. v průmyslu a v posledních letech i v biomedicíně.

Sférické (kulové) nano- a mikročástice se totiž vyznačují jedinečnými fyzikálními a chemickými vlastnostmi. Oproti nekulovým částicím poskytují řadu výhod, jako jsou nejmenší možný povrch a povrchová energie, výhodné tokové vlastnosti, které umožňují snadnou manipulaci, a možnost jejich používání jak ve vsádkovém, tak i kontinuálním uspořádání. Jestliže částice, které jsou často vyráběny z polymerů, disponují více funkcemi současně, jsou pak označovány jako „chytré“ či „inteligentní“. Z nich nacházejí uplatnění zejména magnetické polymerní nosiče s povrchem modifikovaným biologicky selektivními ligandy.

Nespornou výhodou takovýchto částic je možnost řídit jejich transport a lokalizaci vnějším magnetickým polem. Magnetismu částic lze využívat nejen v lékařské diagnostice, jako je magneticko-rezonanční zobrazení tkání, ale i v terapii zahrnující hypertermii, dávkování léčiv a genů do buněk postižené oblasti. Cílené směrování léčiv na magnetických nosičích umožňuje jejich hromadění pouze v požadovaném místě organismu (např. nádoru) a současně dokáže snížit koncentraci přiváděného léčebného preparátu ve zdravých tkáních; vedlejší reakce organismu pacienta na často toxický lék jsou pak minimální. Samozřejmostí je jednotná velikost částic zaručující stejné fyzikální, chemické a biologické vlastnosti, např. stejný obsah léčiva a jeho pravidelné uvolňování. Účinnost dávkování léčiv závisí na vlastnostech nosiče, zejména jeho tvaru, velikosti, povaze povrchu (hydrofilitě, schopnosti adsorbovat bílkoviny atd.), stabilitě, koncentraci, síle vazby léčiva na povrch, kinetice uvolňování léčiva, toxicitě, době cirkulace v krevním řečišti, době a rychlosti zavádění, stavu pacienta atd.

Dalším z perspektivních směrů využití magnetických částic je imunologická analýza spojená s čištěním biologického materiálu. Magnetické separace, které nahrazují tradiční filtrace nebo odstřeďování, se rozšířily zejména v biotechnologických aplikacích a lékařství pro selektivní diagnostiku různých onemocnění. V současné době jsou magnetické částice nedílnou součástí laboratoří na čipu („lab-on-chip“). Použití v biomedicíně zahrnuje izolace a čištění nukleových kyselin z buněk či krve, různé hybridizační metodologie, vysoce citlivé stanovení proteinů, separace buněk, bakterií, virů aj. Na trhu jsou k dispozici nejrůznější soupravy (kity) pro specifické účely. Obsahují nejen magnetické částice, ale i pomocné roztoky, a doprovázejí je detailní návody, jak s nimi zacházet. Magnetická složka je většinou na bázi oxidů železa, které se v porovnání s jinými magnetickými kovy (kobaltem, niklem a jejich slitinami) vyznačují minimální toxicitou.

Železo potřebuje ke svému životu každý organismus. Přednost je dávána zejména maghemitu (γ-Fe2O3), který je ještě méně toxický než magnetit (Fe3O4), protože neobsahuje železité ionty. Klíčovou roli pro budoucí aplikace však hrají chemické vlastnosti povrchu částic, neboť poskytují biokompatibilitu a jsou určující pro jejich další osud v krevním řečišti. Obalová vrstva na povrchu částic brání nežádoucímu slepování (agregaci). Důležitá je i přítomnost funkčních skupin na povrchu pro budoucí zacílení částic do požadované oblasti organismu.

Magnetické polymerní mikročástice

Magnetické polymerní mikročástice jsou primárně určeny pro mimotělní (in vitro) používání. Vývoj monodisperzních částic, tedy kuliček o stejné velikosti, má zajímavou historii. Málokdo dnes ví, že mikrometrové polymerní částice (typicky o průměru 1 až 5 μm) byly připravovány již v osmdesátých letech minulého století na palubě amerického raketoplánu Columbia, dlouho před jeho tragickou havárií v r. 2003. Astronauti přitom využívali beztížného stavu, který je velmi příznivý pro vznik částic jednotné velikosti očkovací emulzní polymerizací. Další důležitý mezník ve vývoji monodisperzních polymerních mikročástic představují práce norského badatele Johna Ugelstada (1921–1997), který několikrát navštívil i Prahu. Ugelstad se systematicky věnoval termodynamickému studiu botnání částic a na základě svých teorií dokázal připravovat částice jednotné a přitom regulovatelné velikosti i v podmínkách gravitačního pole. Posléze založil firmu Dynal, která v průběhu let vyrostla v respektovaného výrobce dodávajícího na globální trh celou škálu rozmanitě funkcionalizovaných monodisperzních polymerních částic, jak nemagnetických, tak i magnetických. Dnes je podnik součástí veliké nadnárodní společnosti Life Technologies.

S tím, jak postupy využívající magnetické polymerní částice šetří výzkumníkům a technikům čas a peníze, stávají se nedílnou součástí současné laboratorní praxe. Povrchově modifikované mikročástice významně usnadňují separace buněk, bílkovin a jiných biomolekul ze složitých biologických směsí s využitím magnetického pole. Příkladem je vychytávání a posléze analýza cirkulujících rakovinných buněk z krve onkologických pacientů pomocí magnetických mikročástic s navázanými protilátkami epiteliální buněčné adhezní molekuly. Magnetické mikročástice tvoří nedílnou součást mikročipové technologie nově vyvíjené pro tento účel v L’Institut Curie v Paříži, se kterým náš ústav spolupracuje. V budoucnu tak bude možná plně automatizovaná charakterizace zhoubných buněk s vysokým rozlišením, aniž bude nutné, tak jako dnes, provádět biopsii, která je pro pacienta zátěží. K analýze přitom budou zapotřebí desetkrát menší objemy vzorků, než je tomu v současnosti. Dále se výrazně sníží doba analýzy i její cena. Netřeba zdůrazňovat, že včasná diagnóza metastáz umožní prodloužit dobu života pacientů.

Multifunkční magnetické nanočástice

Ve středu vědeckého zájmu jsou v současné době i magnetické nanočástice, často o velikosti pouhých 10 nm (obr. 3), jejichž objem je tisíckrát až milionkrát menší než u magnetických mikročástic. Na rozdíl od mikročástic se s magnetickými nanočásticemi počítá pro využití v živém organismu (in vivo). Takovéto částice s navázanými biovektory (protilátkami, bílkovinami, nukleotidy atd.) jsou užitečné ke značení specifických buněk, aniž by nepříznivě ovlivňovaly jejich životaschopnost, funkčnost a schopnost migrace. Pomocí navázaných biovektorů lze směrovat částice nesoucí léčivo či gen do specifické tkáně organismu. Povaha povrchu částic rozhoduje o rychlosti vyloučení částic z organismu, době cirkulace v krevním řečišti, rozdělení do orgánů a tkání a rychlosti difúze částic i léčiv do tkání. Funkcionalizované magnetické nanočástice se osvědčují rovněž jako nová kontrastní činidla pro značení různých typů buněk, které lze pak snadno a neinvazivně pomocí magneticko-rezonančního zobrazení sledovat po jejich transplantaci do poškozené (nemocné) tkáně organismu. Monitorování pohybu těchto buněk a jejich celkového osudu (popřípadě jejich proliferace či diferenciace) po transplantaci hraje klíčovou roli pro další rozvoj regenerativní medicíny a tkáňového inženýrství. V ústavu byly vyvinuty nové povrchově modifikované superparamagnetické nanočástice, které se osvědčily pro značení lidských melanomových buněk vstříknutých do levé srdeční komory myši. Chování, proliferace a životní cyklus melanomových buněk v organismu byly posléze monitorovány magnetickým rezonančním zobrazením. Nanočástice jsou připravovány srážením železitých a železnatých solí ve vodě, popř. teplotním rozkladem organických prekurzorů železa ve vysokovroucích rozpouštědlech. Další využití magnetických nanočástic představuje léčení nádorů hypertermií. Postup vyvinutý na univerzitě Charité v Berlíně spočívá v implantaci magnetických nanočástic do nádoru a zabíjení rakovinných buněk teplem vyvolaným hysterezními ztrátami za působení střídavého magnetického pole.

Univerzální nosič, který by byl vhodný pro libovolné biomedicinální využití, však neexistuje a v praxi musí být částice šity na míru každé jednotlivé aplikaci. Příprava stabilních, tedy neagregujících multifunkčních disperzí a suspenzí tak zůstává nadále výzvou.

Rovněž v Ústavu makromolekulární chemie AV ČR v Praze existuje dlouhá tradice vývoje sférických polymerních částic, ať už na bázi celulózy (tzv. Perlóza, doposud vyráběná v Lovosicích), glycidyl-methakrylátu (tzv. G-gel), nebo 2-hydroxyethyl-methakrylátu (náplně chromatografických kolon vyráběných do devadesátých let minulého století pod názvem Sféron a Separon firmou Tessek Praha). V současné době jsou ze snadno modifikovatelného poly(glycidyl-methakrylátu), poly(2-hydroxyethyl-methakrylátu) nebo celulózy připravovány v ústavu monodisperzní magnetické polymerní částice o průměru obvykle 2 až 4 mikrometry; komerční částice jsou naproti tomu většinou na bázi polystyrénu nebo silikagelu.

V ústavu byla rozvinuta technika vícestupňového botnání a polymerizace (obr. 1 a 2), kterou jsou připravovány funkcionalizované magnetické monodisperzní polymerní mikročástice s povrchem omezujícím nespecifickou sorpci bílkovin a buněk. Metoda vychází z botnání (aktivace) monodisperzních polystyrénových jadérek (připravených bezemulgátorovou emulzní polymerizací) látkou, která je nerozpustná ve vodě. Následuje botnání aktivovaných jadérek roztokem reaktivního monomeru a síťujícího činidla, porogenu (činidlo vytvářející v částicích póry) a iniciátoru, které je zakončeno konvenční suspenzní polymerizací. Po odstranění porogenu je v pórech vzniklých mikročástic v bazickém prostředí vysrážen z železnatých a železitých solí magnetický oxid železa.

Pro praktické použití je důležité, aby oxid železa zůstal zachycen uvnitř polymerních částic, aby nedocházelo k jeho nežádoucímu působení na okolní látky. Přímým kontaktem s oxidem železa může být například nepříznivě ovlivněna činnost buněk nebo inaktivován enzym imobilizovaný na částicích. I proto je na jejich povrch nakonec navazována vrstva albuminu nebo poly(ethylenglykolu), která omezuje nespecifickou sorpci bílkovin z biologického prostředí. V neposlední řadě musí být na magnetických mikročásticích přítomny i funkční skupiny, nejčastěji karboxylové nebo aminové, ale i aldehydové, hydrazidové nebo tosylové, které posléze umožňují chemické navázání specifických ligandů, jako je streptavidin, oligonukleotidy, protein A a nejrůznější protilátky. Chemické navázání ligandů je účinnější a stabilnější a poskytuje rovnoměrnější pokrytí povrchu než prostá adsorpce. Přítomnost specifického biologického ligandu na povrchu částic poskytuje vysokou specificitu a selektivitu pro vychytávání cílových molekul.

Takovéto monodisperzní magnetické polymerní mikročástice nalézají stovky nejrůznějších aplikací, například při stanovení různých patogenních bakterií (E. coli, salmonela, listérie) v potravinách, půdě či biologických vzorcích. Magnetickým přístupem lze eluovat (vymýt) požadovanou látku rychle a ve velmi malých objemech, na rozdíl od sloupcové chromatografie, která obvykle poskytuje výrazně zředěný vzorek a kolona je často ucpána buněčnými úlomky.

Soubory

článek ve formátu pdf: V201402_106-108.pdf (723 kB)

Diskuse

Žádné příspěvky