Komerční prezentace
Registrace uživatele

Přihlašte se k odběru informací, novinek, získejte přístup do diskuzního fóra.

Vesmír č. 10
Vesmír č. 10
Toto číslo vychází
2. 10. 2017
Novinky
Zdarma jedno celé číslo Vesmíru v pdf.
• Říjnové číslo Vesmíru
reklama

Klonovaní pomocníci

Monoklonální protilátky slouží v medicíně a vědě. Princip jejich přípravy byl objeven před 25 lety
Publikováno: Vesmír 79, 446, 2000/8

O protilátkách se mluví jako o účinných „bojovnících“ proti různým bakteriálním či parazitickým nákazám. Tito „bojovníci“ jsou však schopni zasáhnout téměř proti všemu, co do organizmu pronikne zvenčí. Existují protilátky namířené proti bílkovinám, např. enzymům (peroxidáze, lyzozymu) či proteinům strukturním (kolagenu, elastinu), dále proti virům (chřipky ad.), různým organickým sloučeninám (trinitrofenolu) a mnohým dalším látkám, jimž se obecně říká antigeny. Antigen je jakýkoliv cizorodý element, který je schopen v těle vyvolat protilátkovou odpověď.

Protilátky jsou proteiny, které produkuje jedna z mnoha skupin bílých krvinek (leukocytů), a to lymfocyty B. Souhrnně se nazývají imunoglobuliny (Ig) a jejich molekuly se skládají ze dvou těžkých (H) a dvou lehkých (L) polypeptidových řetězců, navzájem pospojovaných čtyřmi disulfidovými můstky (síra je složkou aminokyseliny cysteinu). Každý ze čtyř řetězců obsahuje konstantní a variabilní oblast. Rozdíly ve variabilní oblasti umožňují, že každá jednotlivá protilátka může reagovat jen s jedním antigenem.

Tento fakt potvrdil již kolem r. 1917 Karl Landsteiner 1) při imunizaci králíků kyselinou paraarsanilinovou. Získal sérum, které obsahovalo nově vytvořené protilátky. Jestliže ho smíchal se stejnou antigenní kyselinou paraarsanilinovou, vytvořila se podle předpokladů sraženina dokazující vazbu antigenu s protilátkami. S analogy této kyseliny, které se od původního antigenu lišily jen velmi málo, se však nevysráželo nic.

Monoklonální a polyklonální protilátky
Od narození jsme vystaveni nejrůznějším antigenům a naše tělo proti nim připravuje pestrou škálu protilátek, z nichž každou produkuje jiný B-lymfocyt. Jestliže se později setká antigen s B-lymfocytem, který vyrábí specifickou protilátku namířenou proti němu, tento B-lymfocyt se pomnoží - klonuje. Klon je soubor buněk se zcela stejnou genetickou informací, a proto i protilátky, které syntetizují jednotlivé klonální buňky, jsou totožné - monoklonální. Opakem jsou polyklonální protilátky - směsi imunoglobulinů produkovaných různými klony B-lymfocytů. 2)

Spor mezi instruktivní a selekční teorií

Od padesátých do sedmdesátých let 20. století ovlivňovaly imunologii dvě teorie vzniku protilátek, které se lišily rolí antigenu při syntéze imunoglobulinu.

  • Instruktivní teorie, obhajovaná americkým genetikem J. Lederbergem, předpokládala syntézu určitého „neutrálního“ typu protilátky ve všech B-lymfocytech. Její specifitu by určoval až antigen pohlcený buňkou, který by posloužil jako templát pro další, již negenetickou modifikaci syntetizovaného imunoglobulinu.
  • Selekční (klonální) teorii obhajoval australský biolog Macfarlane Burnet. 3) Podle ní měl mít antigen pouze stimulační roli při pomnožení (tvorbě klonu) určitého B-lymfocytu, který produkoval protilátku proti němu. Předpokládal, že v určitém stadiu embryogeneze jsou geny pro syntézu imunoglobulinů velice náchylné mutacím a v každém B-lymfocytu se uplatní jiná kombinace dále již stabilních změn. Odchylky později vedou k syntéze různých protilátek.

    Dlouhou dobu se vedl urputný boj o to, která z teorií je správná. Instruktivní teorie nedokázala vysvětlit pestrý sled aminokyselin ve variabilní části protilátek. To však neplatilo o části konstantní, v níž bylo po krátké době zjištěno přesné aminokyselinové pořadí. Odpůrci klonální teorie vyčítali jejím přívržencům neschopnost podat důkaz o tom, že každý B-lymfocyt produkuje pouze jednu protilátku a klon vzniká opravdu po antigenním podnětu.

    Klonální teorii nakonec podpořila sama příroda. U pacientů s nádorovým bujením B-lymfocytů byl pozorován výskyt lehkých řetězců imunoglobulinů v moči. Podle objevitelů byla tato látka nazvána Bencova-Jonesova bílkovina. Její aminokyselinové složení bylo určeno u stovek nemocných touto chorobou a struktura bílkoviny se u různých pacientů lišila právě jen ve variabilní oblasti. Vysvětlení bylo jednoduché - u každého nemocného začal bujet jiný jediný B-lymfocyt, a proto se lišil i imunoglobulin produkovaný tímto klonem. Toto onemocnění pomohlo prokázat, že variabilita protilátek je dána geneticky a nikoliv, jak tvrdila instruktivní teorie, modifikací již hotového „univerzálního“ imunoglobulinu.

    Kuchařka monoklonálních protilátek
    V sedmdesátých letech byla uznána selekční teorie, což vyvolalo diskusi o možnosti připravit definovanou protilátku izolací jediného klonu B-lymfocytů, který bychom mohli pěstovat v tkáňové kultuře. Začalo se hovořit o monoklonálních protilátkách.

    Velkou překážkou byl fakt, že poté, co antigen zapůsobí, musí B-lymfocyt dosáhnout konečného stádia svého vývoje - stát se plazmatickou buňkou. Teprve ta produkuje protilátky specifické proti antigenu, který „nastartoval“ její vývoj (diferenciaci), vzápětí však přestane být funkční a zahyne.

    Při prvních experimentech se používaly umělé myší myelomy (nádorové buňky odvozené od B-lymfocytů), které sice dlouhodobě produkovaly monoklonální protilátky, ale nedalo se předpovědět, proti čemu budou namířeny. 4) Až z několika set linií nádorových buněk se dařilo identifikovat klony, jejichž protilátky reagovaly s běžnými, většinou bakteriálními antigeny.

    Velkým milníkem imunologie byl rok 1975, kdy Cesar Milstein a Georges J. F. Köhler 5) vyvinuli techniku, která umožňuje umělý růst buněčné populace jednoho klonu produkujícího protilátky žádané specifity. První fáze přípravy monoklonálních protilátek probíhá stejně jako příprava polyklonálního antiséra. Zvíře, nejčastěji myš, je imunizována vybraným antigenem. Ze sleziny imunizovaného zvířete je připravena buněčná suspenze, která je fúzována s relativně nesmrtelnými myelomovými buňkami. Ty jsou odvozeny od mutantní buněčné linie nádorových B-lymfocytů, která ztratila schopnost syntetizovat molekuly imunoglobulinů. Badatelé tak spojili Pontecorvův objev fúze buněk pomocí polyetylenglykolu 6) a kultivaci v selekčním médiu s hypoxantinem, aminopterinem a tymidinem (selekce HAT). Kultivační metodu objevili v 60. letech John W. Litlefield a Richard L. Davidson.

    Po fúzi jsou hybridní buňky kultivovány v selekčním médiu HAT. Aminopterin blokuje hlavní cestu syntézy nukleotidů, při které jsou nukleotidy syntetizovány z cukrů a aminokyselin. V médiu přežívají pouze buňky vybavené enzymem hypoxantinfosforibozyltransferázou (HGPRT), které využívají přítomný hypoxantin, popřípadě buňky vybavené enzymem tymidinkinázou (TK), využívající přítomný tymidin. Jde o alternativní metabolickou cestu syntézy nukleotidů z jejich prekurzorů (obr. 2). K přípravě hybridomů jsou záměrně vybírány myelomové linie defektní v enzymu HGPRT nebo TK. V důsledku toho myelomové buňky v selekčním médiu hynou. Stejně tak hynou i slezinné buňky, jejichž životnost v tkáňové kultuře je omezena na 1-2 týdny. V selekčním médiu mohou po fúzi přežívat pouze buňky hybridní, vzniklé fúzí B-lymfocytu a myelomové buňky. Od lymfocytu B získaly schopnost syntetizovat nukleotidy vedlejší cestou a od myelomových buněk nesmrtelnost. Hybridní buňky jsou testovány na produkci protilátek žádané specifity a vybrané klony jsou dále množeny. Monoklonální protilátky produkované jednou hybridomovou linií jsou identické, tj. jsou jedné třídy, vážou se na stejné místo antigenu a mají stejné fyzikálně-chemické vlastnosti.

    Antigen znát nemusíme, ale dokážeme proti němu připravit monoklonální protilátku
    Výhodou monoklonálních protilátek je stále stejné složení, a tudíž i standardnost při jejich použití. Monoklonální protilátky umožňují prokázat přítomnost, či nepřítomnost určitého proteinu. Může jím být třeba onkoprotein, jehož nález v séru pacienta včas odhalí počínající nádor. Lze zviditelnit jakékoliv buněčné struktury, například složky cytoskeletu nebo mitochondrií. Stačí mít příslušnou protilátku, která je označena např. fluorescenční látkou. 7)

    Největší výhodou monoklonálních protilátek je možnost jejich přípravy i tehdy, kdy vůbec nevíme, jaký antigen máme hledat. Lze totiž imunizovat celými živými buňkami a přítomnost zajímavé monoklonální protilátky, kterou produkuje jeden ze stovek získaných hybridomů, najdeme testováním cílových buněk. Hybridom, který produkuje zajímavě reagující protilátku, pak dále udržujeme. Protilátka reaguje s jediným antigenem a odhalí nám nejen jeho umístění v buňce, ale i jeho přítomnost či nepřítomnost v ostatních tkáních. Tento antigen pak můžeme izolovat a charakterizovat. Největších úspěchů dosáhli imunologové, kteří již popsali více než 150 různých povrchových proteinů bílých krvinek. U většiny z nich je známá kompletní struktura, a mnohdy i funkce.

Poznámky

1) Laureát Nobelovy ceny (1930) za objev lidských krevních skupin.
2) Aby to bylo ještě zamotanější: Polyklonální protilátka je sice namířena proti jedinému antigenu (např. bílkovině), ale jeho různým místům. Monoklonální protilátka má za cíl jediné místo antigenu.
3) Spolu s Peterem Brianem Medawarem laureát Nobelovy ceny (1960) za objev získané imunologické tolerance.
4) Měly nepředpověditelnou antigenní specifitu.
5) Za svůj objev obdrželi r. 1984 Nobelovu cenu, Vesmír 64, 76, 1985/2.
6) Předtím se používal hlavně pro tvorbu mezidruhových buněčných hybridů. Polyetylenglykol stimuluje fúzi membrán, po níž zpravidla následuje fúze jaderná.
7) O fluorescenčním značení blíže v článku E. Dráberové, Vesmír 79, 438, 2000/8

Soubory

Článek ve formátu PDF: 2000_V446-449.pdf (219 kB)

Diskuse

Žádné příspěvky