Komerční prezentace
Registrace uživatele

Přihlašte se k odběru informací, novinek, získejte přístup do diskuzního fóra.

Vesmír č. 10
Vesmír č. 10
Toto číslo vychází
2. 10. 2017
Novinky
Zdarma jedno celé číslo Vesmíru v pdf.
• Říjnové číslo Vesmíru
reklama

Jak syntetizovat umělé DNA, navíc s modifikovanými bázemi

Publikováno: Vesmír 94, 90, 2015/2
Obor: Biochemie

Uměle připravená a upravená DNA nalézá stále větší uplatněnív diagnostice, lékařské chemii, chemické biologii i v materiálových aplikacích. Kromě klasických chemických syntéz se nám otevřely velké možnosti s využitím syntézy enzymatické. Na tomto poli lze v blízké budoucnosti očekávat řadu nových objevů i praktických aplikací.

Deoxyribonukleová kyselina (DNA – z anglického deoxyribonucleic acid) je nositelkou genetické informace všech buněčných organismů. V buňkách se DNA vyskytuje v podobě dvoušroubovice, jejíž strukturu objasnili v roce 1953 vědci J. Watson a F. Crick (Nobelova cena v roce 1962). DNA v sobě kóduje informace o struktuře, vlastnostech a vývoji celého organismu. V bakteriích (prokaryotických buňkách) se DNA nachází volně v cytoplazmě, zatímco v buňkách rostlin a živočichů (eukaryotických buňkách) je DNA uložena zejména uvnitř buněčného jádra ve formě chromatinu. Strukturou je DNA biologická makromolekula – polymer složený z řetězce nukleotidů. Každý nukleotid obsahuje sacharid deoxyribózu, fosfátovou skupinu a jednu ze čtyř nukleobází – adenin (A), guanin (G), cytosin (C) a thymin (T). Právě pořadí těchto bází kóduje genetickou informaci uloženou v DNA. Dvoušroubovici DNA tvoří dvě navzájem spletená vlákna mířící opačných směrem (obr. 1).

V posledních desetiletích je DNA předmětem intenzivního bádání vědců po celém světě. Byly vyvinuty techniky její izolace z přírodních zdrojů i umělé syntézy. Určování sekvence neznámého vzorku DNA (sekvenování) se stalo rutinní záležitostí. Všechny tyto postupy jsou v dnešní době hojně využívány v mnoha oblastech, například v medicíně pro diagnostiku nemocí či testy otcovství, v kriminalistice k indentifikaci pachatele a v evoluční biologii při hledání příbuzenských vztahů mezi organismy.

Kromě přirozené DNA je dnes často syntetizována a využívána DNA modifikovaná, přičemž k modifikaci (tj. změně chemické struktury) může být využita libovolná komponenta nukleové kyseliny – cukerná část, fosfátová skupina i nukleobáze. Takto upravená DNA nalézá uplatnění v diagnostice, medicinální chemii, chemické biologii i v materiálových aplikacích (kde DNA slouží jako strukturně definované „lešení“, na které lze připojit různé funkční molekuly). Klasickou a velmi efektivní metodou přípravy DNA je dnes již plně automatizovaná chemická syntéza na pevné fázi, která je velmi robustní a již poměrně levná. I tato velmi rozšířená metoda má ovšem řadu problémů a nevýhod, zejména při syntéze velmi dlouhých oligonukleotidů nebo když je potřeba zavést některé reaktivní modifikace (např. pro biokonjugace, připojování molekul k DNA, viz dále).

Alternativou k chemické syntéze je syntéza enzymatická, při níž enzym DNA polymeráza staví vlákno DNA inkorporací nukleotidů s použitím deoxynukleosid-trifosfátů (dNTP) jako základních stavebních bloků. Pomocí této metody lze velmi snadno a efektivně připravit modifikovanou DNA nesoucí různé funkční skupiny připojené k nukleobázím a vývojem této metodiky i jejím dalším aplikacím se intenzivně zabýváme v naší laboratoři.

Základní stavební kámen

V prvním kroku je vždy nutné připravit příslušný modifikovaný nukleosid-trifosfát jako základní stavební kámen. K jeho syntéze jsou využívány moderní metody organické chemie, palladiem katalyzované C-C-spojovací (cross-coupling) reakce, za které byla v roce 2010 udělena Nobelova cena za chemii (R. F. Heck, E. Negishi, A. Suzuki). Tyto reakce byly původně vyvinuty pro práci v organických rozpouštědlech, ale systematickým studiem se podařilo je optimalizovat i pro práci ve vodných roztocích, nezbytných pro práci s nukleotidy a DNA. Pro enzymové syntézy DNA jsou obvykle dostatečná miligramová množství dNTP, která jsou touto metodikou snadno dostupná.

Předchozí vědecké studie ukázaly, že DNA polymerázy tolerují modifikace v poloze 5 u thyminu a cytosinu. U adeninu a guaninu je ovšem třeba nahradit dusíkový atom v poloze 7 za atom uhlíku a zavést zvolenou modifikaci na tento atom uhlíku (obr. 2). Takto modifikované dNTP jsou tolerovány celou škálou DNA polymeráz, z nichž nejúspěšnější a nejobecnější je využití tzv. termostabilních polymeráz. Ty pocházejí z bakterií žijících v extrémních podmínkách, např. v termálních pramenech. Syntéza DNA s využitím těchto polymeráz probíhá při 55–75 °C.

Nejjednodušší metodou enzymové syntézy DNA je tzv. extenze primeru (PEX, obr. 3), což je prodlužování části řetězce primeru přidáváním dalších nukleotidů. DNA polymeráza neumí jednotlivé stavební bloky (dNTP) řadit za sebe bez vzoru a pevného počátku (de novo). Jako vzor slouží polymeráze jedno vlákno DNA (templát) a jako počátek krátký úsek komplementární k templátu (primer, očko). Polymeráza přidává k primeru jednotlivé nukleotidy tak, aby každý nově inkorporovaný nukleotid byl komplementární ke svému protějšku v templátovém vlákně. Pokud je jeden (nebo i více) ze čtyř přirozených dNTP (dATP, dGTP, dCTP a dTTP) nahrazen příslušným dNTP s modifikovanou bází, v nově syntetizované části řetězce bude každá tato nukleobáze nést danou modifikaci.

PEX reakci poté analyzujeme pomocí gelové elektroforézy, která prokáže, zda polymeráza správně rozpoznala a inkorporovala modifikovaný nukleotid. Při použití výše uvedených typů dNTP modifikovaných v poloze 5 či 7 se ve velké většině případů podařilo nalézt alespoň jednu polymerázu, která je efektivně inkorporuje.

V loňském roce naše studie prokázala, že některé modifikované adenosin-trifosfáty jsou překvapivě dokonce lepšími substráty pro některé DNA polymerázy než přirozený nemodifikovaný dATP, protože se přednostně váží do aktivního místa komplexu polymerázy s templátem a primerem. To v budoucnu může umožnit i in vivo enzymovou syntézu modifikované DNA v živých organismech, např. při metabolickém značení, pokud se podaří vyřešit transport modifikovaných dNTP přes buněčné membrány.

Polymerázová řetězová reakce (PCR) je běžná metoda pro amplifikaci DNA. Spočívá v cyklickém ohřívání a ochlazování směsi templátu, přebytku primerů, polymerázy a dNTP, při tom je sekvence templátu exponenciálně zmnožena, a získáme tak miliony kopií. Při použití jednoho či více modifikovaných dNTP ji lze využít k přípravě DNA s velkým množstvím modifikací v obou vláknech (obr. 3). Při použití jednoho modifikovaného dNTP (a tří přirozených) nese přibližně 1/4 bází nově nasyntetizované DNA modifikaci.

PCR je tedy metoda vhodná na přípravu delších dvouvláknových DNA s vysokou hustotou modifikací. Ve srovnání s extenzí primeru je PCR náročnější na substrát (modifikovaný dNTP), neboť nejenže musí být polymeráza schopná inkorporovat modifikovaný nukleotid do jakékoli sekvence (včetně několika modifikací za sebou) a pokračovat v syntéze (nesmí se „zadrhnout“), ale musí být schopna i číst modifikovaný templát.

Kromě těchto hlavních metodik se nám podařilo vyvinout další varianty pro sekvenčně- specifické zavedení jedné modifikace (značky) doprostřed řetězce a pro syntézu kratších jednovláknových oligonukleotidů pomocí spřažení extenze primeru se štěpením nicking endonukleázou (což je enzym, který štěpí pouze jedno vlákno dvoušroubovice).

K čemu směřujeme

Modifikované DNA nacházejí uplatnění v mnoha oblastech, zejména v diagnostice a chemické biologii (obr. 4). Z bioanalytických aplikací je nutno zmínit zejména fluorescenční a elektrochemické značení. DNA nesoucí redoxní značku lze identifikovat na základě charakteristického redoxního potenciálu při elektrochemické analýze (oxidace nebo redukce na elektrodě). Použití čtyř vzájemně se doplňujících značek, kdy každý druh nukleobáze nese jinou modifikaci, lze v principu využít pro redoxní kódování DNA bází, a tím i pro vývoj alternativních minisekvenačních metodik.

Fluorescenční značení nukleobází je již dlouhou dobu hojně využíváno, např. při sekvenování DNA. Cílem našeho současného výzkumu je vyvinout značky, které budou měnit intenzitu nebo i barvu emise při změnách okolí DNA (např. při vazbě proteinu na danou sekvenci). Dosud se podařilo zavést fluorescenční substituenty reagující na změny pH a substituenty, které výrazně zvyšují fluorescenci po vazbě proteinu v důsledku změny polarity prostředí či v důsledku omezené pohyblivosti substituentu interagujícího s proteinem. Tyto fluorescenční značky mohou být využity pro senzory DNA-vazebných proteinů (např. transkripčních faktorů).

Jednou z nejvýznamnějších aplikací modifikace DNA je zavedení chemicky reaktivních funkčních skupin a jejich použití pro spojování (tzv. biokonjugace) s dalšími biomolekulami. Zavedení reaktivní aldehydové skupiny do DNA umožňuje např. barevně detekovat DNA díky typické reakci s arylhydraziny či kovalentně připojit peptid reduktivní aminací. V nedávné době však byly vyvinuty modifikace, které specificky reagují s aminokyselinou cysteinem i za podmínek odpovídajících podmínkám v buňce. Tato metodika byla aplikována pro přípravu stabilních kovalentních konjugátů s peptidy a také ke specifickému vychytávání („cross-link“) DNA-vazebných proteinů obsahujících cystein v rozpoznávacím místě. Tento přístup nyní aplikujeme na vývoj reaktivních DNA sond (molekulových „pastiček“) pro specifické vychytávání různých proteinů a pro identifikaci neznámých DNA-vazebných proteinů.

Přítomnost modifikace ve velkém žlábku DNA má zásadní vliv na možnosti rozpoznání sekvence DNA příslušnými DNA-vazebnými proteiny. Studie štěpení modifikované DNA restrikčními endonukleázami (enzymy, které rozpoznávají a štěpí specifické sekvence bází) ukázala, že zavedením objemné modifikace lze zamezit rozpoznání DNA sekvence proteinem. Avšak některé restrikční endonukleázy tolerují přítomnost menších substituentů na derivátech adeninu a na uracilu a danou sekvenci bází navzdory přítomné modifikaci rozpoznají a rozštěpí.

Této skutečnosti se využívá při konstrukci chemického přepínače rozpoznání dvouvláknové DNA, kdy se objemná modifikace chemickou reakcí převedla na malý substituent, který již rozpoznání a štěpení nebránil. Další studie směřují k využití tohoto principu pro přepínání exprese genů.

Tento krátký článek ukazuje, že kromě klasických chemických syntéz oligonukleotidů a DNA lze s výhodou využívat i metodik bioorganické chemie a enzymových syntéz založených na inkorporaci modifikovaných nukleotidů polymerázami. Otevírá to zcela nové možnosti v oblastech diagnostiky a chemické biologie, kde lze v blízké budoucnosti očekávat řadu nových objevů i praktických aplikací.

Literatura

Hocek M.: Synthesis of base-modified 2'-deoxyribonucleoside triphosphates and their use in enzymatic synthesis of modified DNA for applications in bioanalysis and chemical biology. J. Org. Chem. 79, 9914–9921, 2014.

Kielkowski P., Fanfrlík J., Hocek M.: 7-Aryl-7-deazaadenine 2'-Deoxyribonucleoside Triphosphates (dNTPs): Better Substrates for DNA polymerases than dATP in Competitive Incorporations. Angew. Chem. Int. Ed. 53, 7552–7555, 2014.

Soubory

článek ve formátu pdf: V201502_090-093.pdf (834 kB)

Diskuse

Žádné příspěvky