Komerční prezentace
Registrace uživatele

Přihlašte se k odběru informací, novinek, získejte přístup do diskuzního fóra.

Vesmír č. 10
Vesmír č. 10
Toto číslo vychází
2. 10. 2017
Novinky
Zdarma jedno celé číslo Vesmíru v pdf.
• Říjnové číslo Vesmíru
reklama

Hmotnostní spektrometrie a velké molekuly

Ionizační metody analýzy biologických makromolekul
Publikováno: Vesmír 82, 312, 2003/6
Obor: Chemie
Rubrika: Nobelovy ceny

Nobelovou cenou za chemii byli r. 2002 oceněni tři vědci, kteří přispěli k vývoji metod pro analýzu biomolekul (viz též článek na s. 314). Polovina ceny, kterou získali Američan John B. Fenn a Japonec Koiči Tanaka, byla udělena za „vývoj měkkých ionizačních metod pro hmotnostní spektrometrickou analýzu biologických makromolekul“. Málokdy se stává, aby cenu sdíleli dva vědci, z nichž jeden je bezmála dvakrát tak stár než druhý – Johnu Fennovi je 85 let, K. Tanakovi jen 43.

Vývoj zmíněných analytických metod se týká způsobů převedení molekul biochemické a biologické důležitosti do plynné fáze v podobě iontů. Vzniklé ionty se dají analyzovat hmotnostním spektrometrem, lze určit jejich molekulovou hmotnost, popřípadě z jejich rozpadu dospět k závěrům o jejich struktuře. V poslední době se hmotnostní spektrometrie stala (i díky zmíněným vědcům) jedním z nejdůležitějších způsobů analýzy biologicky významných molekul.

Hmotnostní spektrometrie
Tato metoda využívá pohyb urychlených iontů v kombinaci elektrických a magnetických polí ve vysokém vakuu k zjištění hmotnosti příslušných molekul (přesněji poměru hmotnosti a náboje). Původní metoda byla vyvinuta už koncem 19. století. Anglický fyzik J. J. Thomson ji použil k analýze „pozitivních paprsků“ z výbojů a v popisu pozorovaných hmotností neonu podal první důkaz, že vedle izotopů radioaktivních prvků mohou existovat i stabilní izotopy (za vedení elektřiny ve zředěných plynech dostal r. 1906 Nobelovu cenu). Ve své monografii z r. 1912 zdůraznil obrovský význam hmotnostní spektrometrie pro chemii, zvláště pro chemii analytickou. Díky hmotnostní spektrometrii popsal F. W. Aston většinu stabilních izotopů a objevil také odchylky jejich hmotností od celistvých čísel (Nobelova cena mu za to byla udělena r. 1922). Od té doby byly hmotnostní spektrometrií účinně analyzovány směsi plynů nebo zplynitelných kapalin.

K ionizaci plynných směsí se používala metoda nárazu urychlených elektronů, což byla v polovině 20. století jedna z nejdůležitějších metod pro analýzu směsí uhlovodíku v ropném průmyslu. Od padesátých let minulého století nastal mocný rozvoj hmotnostní spektrometrie a jejích aplikací v nejrůznějších oblastech vědy. Zároveň se rozvíjely metody analýzy hmotnosti ionizovaných částic.

Původní přístroje využívaly kombinaci elektrických a magnetických polí, později byla vyvinuta zařízení (kvadrupolové analyzátory) založená na průchodu iontů vysokofrekvenčním střídavým elektrickým polem, popřípadě na jejich zadržení v tomto poli a postupném vypuzování podle rostoucí hodnoty poměru hmotnosti a náboje (analyzátory na principu iontové pasti). Při konstrukci hmotnostních spektrometrů se rovněž využívá pohyb iontů v kombinaci zkříženého střídavého elektrického pole s magnetickým polem (iontová cyklotronová rezonance či její obměna s Fourierovou transformací) a metody pulzní analýzy urychlených iontů podle doby průletu určité dráhy (průletové spektrometry, reflektron). S vývojem metody se neobyčejně zvýšila citlivost a rozlišovací schopnost hmotnostní analýzy. Oproti původnímu rozlišení iontů s hodnotami poměru hmotnosti a náboje lišícími se o jednotku lze dnes odlišit ionty, u kterých se rozdíl těchto hodnot pohybuje v tisícinách i v ještě menších hodnotách.

Počátkem šedesátých let 20. století se hmotnostní spektrometrie začala používat v organické chemii k analýze a objasnění struktury molekul. Ionizace molekuly sloužila nejen k určení molekulové hmotnosti, ale z rozpadů vzbuzené ionizované molekuly a z výskytu iontových druhů v hmotnostním spektru bylo možno zjistit, jakou strukturu měla původní molekula. V krátké době se metoda rozšířila z výzkumu organických látek na analýzu léčiv, metabolitů a biologicky významných látek s velkou hmotností. Původně používané metody ionizace par látek elektrony, fotony nebo jinými ionty však narážely na obtíže s převedením příliš velkých molekul do plynného skupenství, neboť když se látky zahřály na potřebnou vysokou teplotu, rozložily se.

Ionizace elektrosprejem
V roce 1988 publikoval John Fenn se spolupracovníky nový postup ionizace biomakromolekul, který v možnostech jejich studia znamenal převrat. Využil k tomu ionizaci elektrosprejem: Zředěný roztok analytu se v množství několika mikrolitrů za minutu zavádí velmi úzkou kapilárkou z vodivého materiálu do rozprašovací komůrky. Na kapiláru se vkládá vysoké napětí (v jednotkách kilovoltů), což způsobí, že se kapalina rozprašuje ve formě nabitého aerosolu. Rozpouštědlo se z povrchu aerosolových částic rychle odpařuje, hustota náboje stoupá, až dojde k výbuchu a vzniknou podstatně menší částice, z nichž se molekuly rozpouštědla vypařují ještě rychleji. Ve zředěné plynné fázi tak rychle vznikají ionty zbavené rozpouštědla. Přidávaný plyn pomáhá ionizovaným částicím zbavovat se rozpouštědla a také nadbytečné kinetické energie, a nakonec se systémem vakuových clon a štěrbinových elektrod vytvoří svazek iontů pro hmotnostně spektrometrickou analýzu. Metoda nachází uplatnění v analýze velmi složitých látek, jako jsou peptidy, proteiny, nukleové kyseliny a cukry. Vícenásobný náboj iontů nadto dovoluje analyzovat i pomocí jednoduchých spektrometrů látky o velmi vysoké molekulové hmotnosti, neboť měřený poměr hmotnosti a náboje je při velké hmotnosti, ale zároveň i náboji v rozsahu těchto přístrojů. Má-li např. dvacetinásobně nabitý ion (z = 20) relativní hmotnost m = 40 000, pak poměr hmotnosti a náboje m/z = 2000 zůstává v rozsahu měření jednoduššími přístroji (při jednonásobném nabití by hodnota m/z = 40 000 byla mimo jejich rozsah).

Vakuový instalatér
Stojí zato si povšimnout, že John Fenn své zásadní práce o metodě ionizace elektrosprejem publikoval v jednasedmdesáti letech. Byl v té době už od počátku šedesátých let profesorem Yaleovy univerzity v New Haven, na níž kdysi získal doktorát. V současné době je tento stále aktivní více než osmdesátník emeritním profesorem analytické chemie na Státní univerzitě ve Virginii. Váženým fyzikem byl už dříve. Zásadní význam měly jeho práce o přípravě „molekulových paprsků“ – tenkých řídkých proudů molekul pohybujících se nadzvukovou rychlostí ve vakuu. Mezi vědci zabývajícími se přípravou a použitím atomových a molekulových paprsků byl pokládán za nestora celé této oblasti. Získal řadu ocenění v USA i ve světě. Už dávno jej svým čestným členem jmenoval Výbor mezinárodní konference o molekulových paprscích (vyznamenání, jehož se dostalo jen několika vědcům na světě). On sám však veškeré pocty přijímal s charakteristickou skromností. „Jsem jenom vakuový instalatér,“ říkával při takových příležitostech.

Ionizace s přispěním matrice
Hlavní přínos podstatně mladšího K. Tanaky spočívá v aplikaci metody jemné laserové desorpce (SLD, soft laser desorption) k ionizaci velkých molekul, jako jsou proteiny (1987–1988). Ze skupiny ionizačních metod, které využívají opatrné zplynění pevného vzorku laserovým pulzem, je nejpodstatnější metoda MALDI (matrix-assisted laser desorption ionization, viz např. Jan Havliš, Vesmír 78, 448, 1999), což je ionizace pomocí laserové desorpce s přispěním matrice. Vyvinuli ji a popsali F. Hillenkamp a M. Karas. Vzorek analyzované látky je zabudován do matrice nosné látky (Hillenkamp s Karasem používali organickou matrici na pevném povrchu, kdežto Tanaka používal kovový prášek v kapalné matrici). Krátký jemný laserový pulz ze směsi matrice a sledované látky přímo uvolňuje ionty, které je možno hmotnostně spektrometrickými metodami analyzovat. Podstata metod není zcela objasněna, účinnost ionizace velmi záleží na druhu nosné látky v matrici.

MALDI, SELDI a budoucnost
Dnes již existuje řada velmi účinných laserových ionizačních metod, spočívajících na jemné desorpci. Vedle MALDI jsou to SELDI (surface-enhanced laser desorption ionization), což je laserová desorpce zvýšená povrchem, DIOS (direct ionization on silicon), tj. přímá ionizace na křemíku, a další. Koiči Tanaka zveřejnil práce, za které se mu dostalo ocenění, ani ne jako třicetiletý. Jeho pracovní kariéra je svázána s firmou Šimacu, kde se dosud věnuje dalšímu vývoji hmotnostní spektrometrie.

K rozvoji hmotnostní spektrometrie a jejímu širšímu uplatnění přispěli oba vědci. Dnes tato technika nachází rozsáhlé využití například v diagnostice chorob, ve vývoji léčiv, ale i v kontrole potravin nebo třeba v analýze složek životního prostředí. Důležitou roli hraje také při výzkumu vesmíru.

Koiči Tanaka /* 3. 10. 1959, Tojama, Japonsko/

Je nejmladším laureátem Nobelovy ceny za chemii od roku 1967. V roce 1983 absolvoval Tóhockou univerzitu v japonském Sendai a 1. dubna téhož roku nastoupil jako výzkumný a vývojový inženýr do analytického oddělení Ústřední výzkumné laboratoře firmy Šimacu, kde působí dodnes. Tato firma, která má pobočky po celém světě, vyrábí a prodává různé měřicí a lékařské přístroje.

John Fenn /*1917, New York City, USA/

Roku 1940 získal doktorát na Yaleově univerzitě v New Haven v Connecticutu, počátkem šedesátých let se na téže univerzitě stal profesorem a od r. 1987 je emeritním profesorem. Deset let také pracoval v kosmickém výzkumu. Krátkodobě působil v Itálii na Tridentské univerzitě a v Japonsku na Tokijské univerzitě. Od roku 1994 žije a pracuje na Virginské státní univerzitě v Richmondu. Dostal řadu vyznamenání v USA i v Evropě, mimo jiné je čestným členem výboru mezinárodní konference o molekulových paprscích.

Soubory

Článek ve formátu PDF: 2003_V312-316.pdf (207 kB)

Diskuse

Žádné příspěvky