Komerční prezentace
Registrace uživatele

Přihlašte se k odběru informací, novinek, získejte přístup do diskuzního fóra.

Vesmír č. 10
Vesmír č. 10
Toto číslo vychází
2. 10. 2017
Novinky
Zdarma jedno celé číslo Vesmíru v pdf.
• Říjnové číslo Vesmíru
reklama

CRISPR-Cas9 – průlom v přírodních vědách

 

Publikováno: Vesmír 94, 288, 2015/5
Obor: Biologie

 

Zásahy genových inženýrů do dědičné informace nejrůznějších organismů zhusta připomínaly střelbu do tmy. Nikdy nevěděli, zda a kam se strefí. V posledních několika letech se genoví inženýři proměnili za střelců na slepo v genetické Vilémy Telly. Nové techniky jim dovolují přesně zacílit do obrovské dědičné informace s vysokou šancí, že vybraný cíl skutečně zasáhnou. Otevřely se tím donedávna netušené možnosti.

Zinkové prsty s nukleázou

Klasické metody genového inženýrství umožňují vnášet vybrané úseky molekuly DNA do dědičné informace nejrůznějších organismů, ale nedovolují předem určit, kam se tyto molekuly zabudují. Geny, které chtějí genoví inženýři vnést do dědičné informace živočicha, lze například ukrýt do upraveného viru. Virus je od přírody vybaven schopností zabudovávat svou dědičnou informaci do dědičné informace hostitelské buňky. Ve volbě místa, kam se „vmáčkne“, ale není příliš vybíravý. Pokud tedy použijeme upravený virus jako trojského koně, který propašuje DNA do dědičné informace savčí buňky, jsme vydáni na pospas náhodě, s jakou virus provede požadovaný trik. Virus se přitom může například nabourat do některého genu a poškodit ho.

První nástroj, který dovoloval výběr místa, kde vědci provedou zásah do dědičné informace, nabídly enzymy nukleázy propojené s bílkovinami označovanými jako zinkové prsty. Bílkovinné řetězce zinkových prstů jsou tvořeny zhruba třiceti aminokyselinami, které ion zinku drží v potřebné prostorové „prstové“ konfiguraci. Zinkové prsty jsou přirozenou součástí bílkovin, které se vážou na dvojitou šroubovici DNA a regulují aktivitu genů. V závislosti na pořadí svých aminokyselin se „prst“ váže na určitou kombinaci tří písmen genetického kódu. Pokud genoví inženýři propojili čtveřici genových prstů, získali tak „slídícího psa“ schopného „vyčmuchat“ v miliardách písmen genetického kódu dědičné informace buňky kombinaci dvanácti písmen genetického kódu. Těch nemusí být v celé dědičné informaci mnoho. V ideálním případě se tam nachází jen jedna jediná.

Když se na „lokomotivu“ z několika zinkových prstů připojí „vagonek“ v podobě enzymu nukleázy, zaveze „lokomotiva“ nukleázu v dědičné informaci do vybrané „stanice“ s přesně stanoveným pořadím písmen genetického kódu. Tam odvede enzym svou práci a přestřihne vlákno DNA. Buňka toto poškození DNA zjistí a zahájí jeho opravu. Často se přitom dopustí chyby a dané místo DNA opraví špatně. Pokud byla cílová „stanice“ pro „vlak“ ze zinkových prstů a nukleázy zvolena uvnitř důležité části genu, je tento gen vážně poškozen a vyřazen z činnosti. Z toho, jak se po takovém „knokautování“ genu chovají buňky či celý organismus, vědci usuzují, k čemu je gen dobrý.

Pokud se do buňky kromě „lokomotivy“ zinkových prstů s „vagonkem“ nukleázy dostane i vybraný úsek DNA, může buňka tuto cizí DNA použít jako záplatu při opravě „díry“ vytvořené v DNA nukleázou. Tak se dostane cizí dědičná informace na přesně vybrané místo.

TALEN

Zinkové prsty spojené s nukleázami znamenaly bezpochyby zásadní změnu v genovém inženýrství, ale do dokonalosti měly daleko. „Lokomotivy“ nepříjemně často zabloudily do jiných „stanic“, než které měly naprogramované ve svém pomyslném jízdním řádu. Zásah do DNA pak proběhl na nechtěném místě. Pro některé „stanice“ bylo obtížné získat „lokomotivy“ zinkových prstů, jež by tam chtěly jezdit. A také výroba celého „vlaku“ byla složitá, a to nejen po technické stránce. Kryly ji četné patenty, což situaci dále komplikovalo.

Není divu, že vědci hledali za zinkové prsty náhradu. Našli ji v proteinech, jimiž jsou vybaveny bakterie rodu Xanthomonas. Tyto proteiny se označují zkratkou TALE (z anglického transcription-activator like effector) a bakterie je používá k ovládání genů buněk, které napadne. S pomocí TALE spouští bakterie v buňce procesy, jež jí jdou k duhu. Pro genové inženýry bylo důležité, že rozluštili, jakým způsobem bakterie skládá proteiny TALE, aby se vázaly na konkrétní písmeno genetického kódu. Mohli pak vyrábět jednotlivé proteiny, skládat je do řetězců a ty využívat jako „slídicího psa“ pro vyhledání dané kombinace písmen genetického kódu v rozsáhlé dědičné informaci.

Také z proteinů TALE bylo možné vytvořit „lokomotivu“ a zapřáhnout za ni „vagonek“ enzymu nukleázy. Vznikl tak „vlak“ označovaný jako TALEN (za písmenem N se skrývá nukleáza). Tento „vlak“ bylo možné využívat pro stejné účely jako „vlaky“, kde je nukleáza „tažena“ zinkovými prsty. Cílené narušení genů nebo vnášení cizích molekul DNA do přesně vybraného místa dědičné informace bylo spolehlivější a účinnější. „Slídicí psi“ TALE na rozdíl od zinkových prstů neignorovali některé kombinace písmen genetického kódu. TALE jsou však podobně jako zinkové prsty proteiny, a s těmi není jednoduchá práce. Konstrukce TALENových „vlaků“ tak zůstává i nadále poměrně komplikovaná.

Raketový nástup CRISPR

V roce 2012 vybral vědecký časopis technologii založenou na TALEN mezi desítku největších objevů. V té chvíli však už bylo jasné, že molekulární genetika má k dispozici něco mnohem lepšího. Onou slibnou novinkou byl CRISPR – „slídicí pes“ zcela nového typu, schopný „vyčmuchat“ v dědičné informaci vybranou sekvenci písmen genetického kódu ještě spolehlivěji než TALEN. Hlavní přednost tohoto „slídicího psa“ spočívá v tom, že není tvořen molekulami bílkovin, ale krátkými řetězci ribonukleové kyseliny (RNA). Výroba krátkých řetězců RNA je neskonale jednodušší, a tudíž i levnější než výroba bílkovinných „slídicích psů“. To umožnilo doslova raketový nástup technologie CRISPR pro ty nejrůznější aplikace. Duchovní matky celé technologie Jennifer Doudna(ová) a Emmanuelle Charpentier(ová) za ni dostaly v roce 2015 prestižní Breakthroug Prize za přírodní vědy. Protože se tyto ceny pyšní přívlastkem „nejštědřejší vědecké ceny světa“, odnesly si obě vědkyně spolu s „drátěně“ vyhlížející plaketou také 3 miliony dolarů. Po právu. Nás může těšit, že se na vývoji technologie CRISPR v týmu Jennifer Doudnaové zásadním způsobem podílel i český vědec Martin Jínek.

Úžasný imunitní systém bakterií

U zrodu technologie CRISPR stál překvapivý objev z roku 2007, kterým byl u bakterií a archeí odhalen úžasný imunitní systém.1) Ukázalo se, že si bakterie poté, co přežila napadení virem, dokáže na další atak stejných virů připravit účinnou obranu. Posbírá krátké zlomky dědičné informace poraženého viru a uloží si je do vlastní dědičné informace. Vytvoří si tak cosi jako kriminalistickou kartotéku otisků prstů, podle kterých nejen pozná virového „recidivistu“, jenž se do ní pokouší opětovně „vloupat“, ale zároveň získává velmi účinnou zbraň pro jeho spolehlivou likvidaci. Celý systém pracuje tak specificky, že bakterie neriskuje „justiční přehmat“, při němž by si útočníka spletla třeba s vlastní dědičnou informací.

Jako „kartotéka“ pro uložení „otisků prstů“ virových útočníků slouží bakterii úsek dědičné informace označovaný jako CRISPR (zkratka z anglického Clustered Regularly Interspersed Short Palindromic Repeats). Bakterie si vloží úlomky dědičné informace poraženého viru do své DNA kartotéky. Pokud se buňka potká s virem znovu, přepíše archiv „otisků“ do jedné dlouhé molekuly RNA. Ta představuje jakési album identifikačních znaků a bakterie si ho rozstříhá na jednotlivé „otisky“. Ke každému otisku připojí speciální enzym nukleázu označovanou jako Cas9 (Cas je zkratka z CRISPR-associated čili „spojený s CRISPR“). Bakterie tak disponují vlastními „slídicími psy“ v podobě krátkých úseků RNA, které jsou s to nalézt odpovídající úsek dědičné informace útočících virů. Na tyto RNA „lokomotivy“ si bakterie samy připojí „vagonek“ nukleázy Cas9. Vytvoří tak „vlak smrti“ namířený proti vetřelci, na něhož byly od předchozího útoku připravené. Nukleázy Cas9 navedené na cíl krátkými řetězci RNA rozstříhají dědičnou informaci viru na celé řadě míst, a tím ho spolehlivě zlikvidují.

CRISPR-Cas9 – nový nástroj molekulárních genetiků

Martin Jínek jako první vyrobil „vláčky“ spojením nukleázy Cas9 s molekulou RNA zacílenou dvacítkou písmen genetického kódu na vybrané místo dědičné informace buňky.2) Tyto „vláčky“ jezdily spolehlivě do vybrané „stanice“ v dědičné informaci. Bloudily jen zcela výjimečně. „Vagonek“ Cas9 odváděl perfektně svou práci při štípání řetězce DNA v přesně určeném místě. Podobně jako s mnohem těžkopádnějšími technologiemi zinkových prstů spojených s endonukleázou či TALEN lze i s technologií CRISP-Cas9 provádět cílené narušení vybraných genů v přesně zvoleném místě nebo vnášení úseků cizí DNA do jednoznačně určených míst dědičné informace. Technologie CRISPR-Cas9 se tak stala ze dne na den hitem laboratoří. Když ji vědci nasadili na buňky, dosahovali vyblokování genů u vysokého procenta buněk. Často se podařilo v jedné buňce vyřadit najednou z činnosti obě kopie genů, jež organismus dědí od otce a matky. Podobně zdatná je technika i při vnášení genů do dědičné informace. To byl u předchozích technik kousek zcela nevídaný.

Do buňky je možné „vypravit“ hned několik různých „vláčků“, a ty pak „zajedou“ do různých cílových „stanic“. Lze tak provést simultánně hned několik různých zásahů do dědičné informace. U laboratorních myší se tímto způsobem podařilo vyblokovat najednou hned šest genů. Pokud je zásah proveden na jednobuněčném zárodku vzniklém po oplození vajíčka spermií, přenášejí se takto navozené změny v dědičné informaci do všech buněk jedince, který se z embrya vyvine. Čínští vědci dokázali pomocí technologie CRISPR-Cas9 upravit dědičnou informací makaků, čímž potvrdili, že bude možné zasahovat i do DNA člověka.

Co vše přinese do laboratoří a našeho života „doba CRISPRová“, lze jen obtížně odhadovat. Každý týden přinášejí vědecké časopisy záplavu informací o nových vylepšeních techniky a jejím nasazení k řešení dalších problémů. Zdá se, že stojíme na samém počátku velkého vědeckého dobrodružství.

Literatura

 

Poznámky

1) Odhaduje se, že tento imunitní systém využívá polovina všech druhů bakterií a plných 90 % všech archeí.

2) Podrobnější informace lze nalézt např. v on-line publikaci Doudna J. A., Charpentier E., Science 346, 1258096, 2014.

Citát

 

Soubory

článek ve formátu pdf: V201505_288-290.pdf (399 kB)

Diskuse

Žádné příspěvky