Komerční prezentace
Registrace uživatele

Přihlašte se k odběru informací, novinek, získejte přístup do diskuzního fóra.

Vesmír č. 10
Vesmír č. 10
Toto číslo vychází
2. 10. 2017
Novinky
Zdarma jedno celé číslo Vesmíru v pdf.
• Říjnové číslo Vesmíru
reklama

Boj s HIV je i po 30 letech svízelný

Publikováno: Vesmír 93, 441, 2014/7
Obor: Virologie

Po identifikaci viru HIV v roce 1983 se zdálo, že bude snadné vyvinout vakcínu, která by problém AIDS definitivně vyřešila. Do dnešní doby, přes nesmírné úsilí řady vědců i farmaceutických společností, však není k dispozici jediná účinná vakcína. Důvodem je velmi nepřesné kopírování genomu retrovirů, kvůli kterému se v těle pacienta denně vytvářejí tisíce různých mutantních virů. Řada z nich sice není schopna replikace, ale některé z nich jsou naopak rezistentní k vakcínám a dalším lékům vzhledem k pozměněné struktuře mutovaných proteinů. Tyto nové kmeny, necitlivé k inhibitorům, poté v populaci převládnou. Proto se pro léčbu pacientů trpících AIDS aktuálně využívá vysoce účinná antiretrovirová terapie,1) která spočívá v současném použití tří inhibitorů virových enzymů, zejména proteázy, reverzní transkriptázy a nově i integrázy. Tento postup významně snižuje riziko selekce rezistentních kmenů HIV a je nyní jedinou schválenou terapií proti AIDS. Přesto je však nutno pacienty sledovat i v průběhu léčby a změnit kombinaci inhibitorů, narůstá-li množství viru v krvi. Pro dlouhodobě účinnou antiretrovirovou terapii je ale potřebné hledat nové inhibitory, působící i na další kroky životního cyklu retrovirů (viz obr. 1), jako jsou například vnitrobuněčný transport virových proteinů, skládání virové částice a její „pučení“. Zatím však pořád platí, že nejúčinnější ochranou před HIV je prevence. Použitím jakéhokoliv z dostupných inhibitorů HIV totiž nedochází k úplnému odstranění virů z těla pacienta a ty přetrvávají ve formě integrovaného proviru v lidském organismu. Celý genom je totiž vložen do chromozomu infikovaných buněk působením virového enzymu, integrázy. Navíc mají používané inhibitory řadu nežádoucích vedlejších účinků.

Nadějnou strategií by v tomto ohledu mohla být genová terapie cílená na všechny buňky obsahující provirus. Prvním krokem v tomto směru bylo použití tzv. ex vivo genové terapie, upravených při transplantaci kmenových buněk kostní dřeně tak, aby neprodukovaly jeden z povrchových proteinů lymfocytů. Ten totiž slouží jako pomocný receptor nutný pro vstup HIV do buňky, a umožňuje viru tyto cílové buňky imunitního systému, tj. makrofágy a Th-lymfocyty, specificky rozpoznat.

V poslední době se pozornost zaměřuje na hledání dalších terapeutických přístupů včetně inhibice skládání virové částice. K cílenému návrhu inhibitorů tohoto procesu je nutné pochopení proteinových interakcí v částici i podrobná znalost uspořádání a struktury nezralé nebo zralé retrovirové částice.

Jak vzniká retrovirová částice?

Retrovirus nejprve vzniká ve formě nezralé částice (obr. 1A) složené z bílkovin velké molekulové hmotnosti, nazývaných polyproteinové prekurzory. Takto složená partikule opouští buňku a poté jsou prekurzory specificky štěpeny virovou proteázou na proteiny zralé částice (obr. 1B). Teprve tento přechod ve zralou částici, spojený se strukturní reorganizací, činí virus plně infekčním. My se věnujeme studiu struktury virových částic a jejich transportu v infikované buňce.

Retroviry jsou, stejně jako ostatní viry, striktní paraziti a nemohou se množit mimo hostitelskou buňku. K tomu, aby mohly replikovat svoji genetickou informaci, totiž potřebují řadu buněčných proteinů a buňka také zajistí vše potřebné pro tvorbu jejich vlastních proteinů. Přestože cytoplazma je přirozené prostředí pro vytvoření virové částice, podařilo se složit in vitro (ve zkumavce) modelovou částici z izolovaných retrovirových proteinů produkovaných v geneticky upravené bakterii (Escherichia coli, nesoucí gen kódující polyproteinový prekurzor strukturních proteinů viru). Tento systém poskytuje velké množství částic, které jsou vhodné pro studium struktury viru, jeho interakcí s buněčnými proteiny a pro hledání inhibitorů skládání retrovirů.

O výhodnosti tohoto modelu svědčí i to, že byl převzat řadou světových laboratoří, zabývajících se těmito otázkami. Skládání částic in vitro má význam např. pro vývoj nových inhibitorů tvorby HIV. Pro sledování účinnosti takovýchto inhibitorů jsme vyvinuli test, který byl optimalizován a patentován. Nyní jej v rámci licence prodává firma GeneriBiotech.

Metoda přípravy částic in vitro může být využita i pro přípravu vektorů pro genové terapie, kdy jsou terapeutické molekuly cíleny na místo určení v nemocném organismu částicemi modifikovanými na povrchu tak, aby interagovaly např. s receptory nádorových buněk.

Pro návrh inhibitorů i další aplikace je důležité znát strukturu virové částice. Proto byl (ve spolupráci VŠCHT Praha, ÚOCHB AV ČR a skupiny Dr. Johna Briggse z Evropské laboratoře molekulární biologie – EMBL v Heidelbergu) pomocí kryoelektronové mikroskopie a tomografie získán trojrozměrný obraz nezralé částice modelového retroviru (Mason-Pfizerova opičího viru: M-PMV). Snímek z elektronového mikroskopu v rozlišení (8 Å) je tak detailní, že zobrazuje obrysy jednotlivých proteinů ve virové částici. To umožnilo přesné vložení jednotlivých, dříve vyřešených trojrozměrných struktur těchto proteinů do získaného detailního snímku a vytvoření pseudoatomového modelu celé částice (obr. 2 A–D).

Porovnáním této struktury nezralé částice s krystalografickými daty popisujícími zralý virus jsme vysvětlili mechanismus strukturních změn během zrání viru (obr. 3).

Díky velké podobnosti retrovirových proteinů bylo možno zobecnit tato data, získaná pro modelový virus také na HIV. Detailní znalost struktury retrovirové částice může přispět k racionálnímu (in silico) návrhu inhibitorů skládání HIV a dalších retrovirů.

Následně se podařilo vyřešit strukturu částice HIV. Porovnání této struktury s dříve vyřešenou strukturou viru M-PMV ukázalo, že různé retroviry mohou mít odlišné uspořádání proteinů v nezralé částici, přestože prostorová struktura těchto proteinů je u obou retrovirů identická. Tento rozdíl může být způsoben odlišnými nároky na stabilitu struktur různých virů, které se liší tím, že skládají nezralé částice na membráně (v případě HIV) nebo ve vodném prostředí cytoplazmy (M-PMV), viz obr. 4.

Kam a jak jsou cíleny v buňce virové proteiny, aby mohl vzniknout nový virus?

Intracelulární tvorbě nezralých částic předchází transport virových proteinů na místo, kde dojde k vytvoření koncentrace, která je dostatečná pro iniciaci skládání viru (obr. 4). V této souvislosti studujeme vzájemné interakce virových proteinů a roli buněčných motorů a transportních mechanismů při dopravě virových částic na místo skládání.

Ukázali jsme, že transport na místo skládání viru (u jádra infikované buňky v případě M-PMV) je zprostředkován tzv. dyneinovým molekulovým motorem, s nímž specificky interaguje počáteční doména strukturního polyproteinu M-PMV. Obr. 5 ukazuje, že pokud je molekulový motor aktivní, jsou proteiny (zeleně obarvené) transportovány po proteinových vláknech cytoskeletu k jádru (obarvenému modře). V případě potlačení produkce složek molekulového motoru jsou virové proteiny akumulovány pod cytoplazmatickou membránou.

Vysvětlení mechanismu této interakce se podařilo díky porovnání dvou variant téhož virového proteinu, lišících se pouze jedinou aminokyselinou. Přes zdánlivě malou změnu mění tato bodová mutace cílové místo transportu strukturních proteinů M-PMV z intracelulární oblasti u jádra, na cytoplazmatickou membránu (podobně jako u HIV, kde jsou polyproteiny cíleny přímo na membránu). Důvod spočívá v tom, že u standardního typu je doména interagující s molekulovým motorem na povrchu molekuly (obr. 6 vlevo), zatímco u mutantu je skryta uvnitř molekuly (obr. 6 vpravo), a nemůže se tudíž vázat na motor, který by ji transportoval k jádru.

Znalost uspořádání proteinového povrchu retrovirové částice pomáhá k objasnění interakcí s buněčnými proteiny a k vysvětlení mechanismu transportu virových proteinů v infikované buňce. Na základě porovnání struktur zralé a nezralé virové částice byl také simulován proces zrání retrovirové částice, který přispívá k rozšíření obecných znalostí o životním cyklu retrovirů.

Přínosem vyřešení detailní struktury retrovirové částice je pomoc při hledání nových inhibitorů skládání a zrání HIV. Jednou z možností je například využití struktury pro počítačové modelování interakcí s organickými molekulami pro cílené navrhování látek blokujících interakce virových proteinů a zabraňujících složení částice.

Poznámky

1) HAART z angl. Highly Active Antiretroviral Therapy.

Soubory

článek ve formátu pdf: V201407_441-443.pdf (877 kB)

Diskuse

Žádné příspěvky